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Cell Counting Kit-8

細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒(CCK-8)說(shuō)明書(shū)

Cell Counting Kit-8（CCK-8 kit），是一種基于WST-8原理，廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的試劑盒，具有高靈敏度、無(wú)放射性的特點(diǎn)。

    WST-8在電子耦合試劑存在的情況下，被線(xiàn)粒體內(nèi)脫氫酶還原生成橙黃色的甲臜染料（formazan）。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線(xiàn)性關(guān)系。

圖1 WST-8形成formazan原理圖

CCK-8溶液可以直接加入到細(xì)胞中檢測(cè)不需要預(yù)配各種成分。而且WST-8 對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性。加入 CCK-8 溶液顯色后，可以在不同時(shí)間反復(fù)用酶標(biāo)儀讀板，檢測(cè)時(shí)間更加靈活，便于確定測(cè)定時(shí)間。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

Ø   制備細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，接種細(xì)胞；

Ø  按比例（例如：1/2 比例）依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做3-5 個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組3-6 個(gè)重復(fù)孔。每孔約100μl 細(xì)胞懸液。

Ø  細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2-4 h，之后加入10μl CCK-8 試劑：加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以助勻。

Ø 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育一定時(shí)間后測(cè)定450nm 吸光度，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)(X 軸)，吸光度為縱坐標(biāo)(Y 軸)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可以測(cè)定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量（使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的前提是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入CCK-8 后的培養(yǎng)時(shí)間。）

細(xì)胞活性檢測(cè)

Ø  在 96 孔板中接種細(xì)胞懸液，培養(yǎng)板于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h；

Ø   每孔加入 10 μL 的 CCK-8 試劑 (注意不要產(chǎn)生氣泡) ；

Ø  將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4 h；

Ø 用酶標(biāo)儀測(cè)定在 450 nm 處的吸光度。

細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)

Ø  在 96 孔板中接種細(xì)胞懸液，培養(yǎng)板于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h；

Ø  向培養(yǎng)板加入不同濃度的待測(cè)藥物；

Ø   將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間；

Ø  每孔加入 10 μL 的 CCK-8 試劑 (注意不要產(chǎn)生氣泡)；

Ø  將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4 h；

Ø  }用酶標(biāo)儀測(cè)定在 450 nm 處的吸光度。

存儲(chǔ)條件：

4℃避光可以保存18個(gè)月。常溫保存2-3周。如需長(zhǎng)期保存，建議-20℃避光。

所需要的配套設(shè)備：

CO₂培養(yǎng)箱、10ul移液器、100~200ul移液器、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、450nm酶標(biāo)儀

注意事項(xiàng)：

Ø   接種細(xì)胞時(shí)要注意細(xì)胞混合均勻，避免細(xì)胞沉淀造成每孔細(xì)胞數(shù)量不均，

Ø   96 孔板周?chē)蝗θ菀渍舭l(fā)，可以在周?chē)蝗酉嗤康?/span>PBS或培養(yǎng)基；另一方面，可以把 96 孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。

Ø  對(duì)于不同的細(xì)胞CCK-8染色時(shí)間不同，檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)，由于白細(xì)胞不容易被顯色，需要增加培養(yǎng)時(shí)間或者加大細(xì)胞接種數(shù)量，對(duì)于貼壁細(xì)胞，加入CCK-8試劑培養(yǎng)時(shí)間一般為 1-4 小時(shí)，但在培養(yǎng) 30 分鐘左右可取出肉眼觀察顯色程度，對(duì)于懸浮細(xì)胞而言，加入CCK-8培養(yǎng)1-4小時(shí)后取出肉眼觀察顯色程度，（由于細(xì)胞種類(lèi)較多，具體需要摸索條件）。

Ø   建議采用多通道移液器，以減小平行孔間的差異。

Ø   斜貼著培養(yǎng)板壁加入CCK-8試劑。確?？變?nèi)沒(méi)有氣泡，否則會(huì)干擾測(cè)定。

Ø  CCK-8檢測(cè)依賴(lài)于脫氫酶催化的反應(yīng)，還原劑會(huì)干擾檢測(cè)，如果待檢測(cè)體系中存在還原劑時(shí)，需考慮到背景OD值。

Ø   培養(yǎng)基中的酚紅不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過(guò)

Ø   扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。

Ø   CCK-8 試劑對(duì)細(xì)胞的毒性非常低。它和活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶持續(xù)反應(yīng)使溶液顏色不斷加深，OD 值不斷增加 (注: 活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶是持續(xù)產(chǎn)生的) 。

Ø   要測(cè)定細(xì)胞的具體數(shù)量，建議同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

Ø  以下方法可以終止 CCK-8 反應(yīng) (96 孔板) ：(a). 在顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放置 4°C 冰箱內(nèi)。(b). 每孔加 10 μL 0.1 M HCl溶液。(c). 每孔加 10 μL 1% (w/v) 的 SDS (十二烷基硫酸鈉) 溶液。注意：反應(yīng)停止后，應(yīng)在 24 小時(shí)內(nèi)測(cè)定。

特別聲明：本產(chǎn)品僅限于科研使用，不可用于其他用途！